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黄建华，王晓姣，魏照辉，张震宇*，孙付保*
(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，)
摘要：对以L-脯氨酸为底物，产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coliBL21(DE3)/pET21a-ptrp2-H3P出发，通过易错PCR随机突变和定点突变处理，利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、FY、YI，并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBT-R58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-FY、TBT-YI。发酵24h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌，依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24h产量达到了.3mg/L。与重组菌相比，TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。
关键词：重组大肠杆菌；易错PCR；顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)；脯氨酸-3-羟化酶；定向改造
羟基-L-脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)是一种亚氨基酸，分子式为C5H9NO3，为L-脯氨酸经过羟基化后得到的产物。由于L-脯氨酸有2个不对称的碳原子，根据羟基所在位置的不同，形成的羟脯氨酸可以分为4种立体异构体，分别是反式-4-羟脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸和顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)。H3P在自然界中十分稀有[1]，现有资料报道其存在于产放线菌素、宜他霉素和远霉素等次级代谢物的微生物中[2]。H3P在医药[3-4]、化学合成[5]、不对称合成等领域有着较广泛应用[6]。但其含量的稀少成为限制其应用的最主要因素。
随着微生物资源的开发和利用，研究者们发现了一些能够合成H3P的微生物。年，MORI，SHIBASAKI等人在筛选产脯氨酸-4-羟化酶菌株的过程中，发现链霉菌(Streptomycessp.)TH1能够产一种脯氨酸-3-羟化酶，该酶能够将游离的L-脯氨酸羟基化为H3P，之后他们发现脯氨酸-3-羟化酶还存在于包括产远霉素的链霉菌和芽孢杆菌等多种微生物体内[7]。这也是在微生物中发现脯氨酸-3-羟化酶的首次报道。年，ROBERT等通过重组大肠杆菌的构建，实现了脯氨酸-3-羟化酶在大肠杆菌中的异源表达，20L发酵罐发酵8h后，加入一定量的IPTG进行诱导，以收集的菌体为酶源，在10L的反应体系中60h能够催化产生H3P约9.1g/L[8]，这也是目前文献中报道的最高水平。
自然界中的酶经过百万年的自然选择和生物进化，拥有的较高特异性与较强催化能力。但由于野生酶已经适应了自身的作用环境，其表现的活性及稳定性往往无法达到理想目标[9]。随着科技的发展，借助突变及重组等技术，进化的过程可以在试管中被模拟，被称为体外定向进化[10]。其在改变底物特异性、增强热稳定性、提高有机溶剂耐受性、改变对映选择性等方面有诸多应用。
年，LEUNG等提出了利用易错PCR技术进行定向进化，由CADWELL等于年进行了完善和改进[11]。易错PCR技术简便快捷，主要思路是降低DNA聚合酶的保真度，并于标准PCR条件的基础上，通过微调PCR的反应体系及条件以增加突变频率，以此向基因中引入随机的碱基突变，从而构建具有多样性序列的突变基因文库[12]。作为一种有效的定向进化手段，随机突变结合高通量筛选的技术成为新酶发现与改造最常用的工具之一[13]。本研究以之前获得的脯氨酸-3-羟化酶经大肠杆菌密码子优化后的基因作为研究对象，采用易错PCR技术进行改造，以达到提高其产量的目的。
1材料与方法1.1材料
1.1.1菌株、质粒及引物
重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET21a-ptrp2-H3P菌株由本实验室构建并于-80℃保存，其中P3H基因由多拷贝质粒pET21a-P3H携带转入宿主菌。
本研究易错PCR引物、定点突变引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1，表2)，引物P1，P2用于从质粒pET21a-P3H上扩增脯氨酸-3-羟化酶基因，其设计原理见参考文献[14]。
表1易错PCR引物
Table1Primersforerror-pronePCR
表2定点突变PCR引物
Table2Primersforsite-directedmutationPCR
1.1.2酶和试剂
柱式质粒小量提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、2×SuperpfuMix(PCR扩增酶)、DpnⅠ：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；随机突变试剂盒：购自AgilentTechnologies公司(美国)；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.1.3培养基
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，以去离子水稀释配制至pH7.0～7.2，℃灭菌15min。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖10，KH2PO42，(NH4)2SO42，NaCl2，L-脯氨酸5，以去离子水稀释配制，pH7.5，于℃灭菌20min。
1.2方法
1.2.1易错PCR(error-pronePCR)随机突变[14]
以含P3H基因的重组质粒(pET21a-P3H)为模板，利用易错PCR向P3H基因中随机引入突变。易错PCR反应的上下游引物分别为P1，P2。50μL易错PCR反应体系包含5μL10×易错PCRBuffer、1μLdNTPMixture(40mmol/L)、上下游引物各10pmol、1μLGeneMorphПDNAPolymerase(2.5U/μL)和1μLpET21a-P3H重组质粒模板。通过调整反应体系中质粒模板浓度控制随机突变的频率。反应条件为：94℃5min；94℃1min，68℃1min，72℃1mins，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
以易错PCR产物作为引物及含有目的基因的表达载体(pET21a-P3H)作为模板进行全质粒PCR，反应体系(50μL)包含0.5μL引物、0.5μL模板质粒及25μL2×SuperpfuMix。其反应条件为68℃5min;94℃5min；94℃30s，63℃30s，72℃s，30个循环；延伸10min。然后，用DpnⅠ内切酶在37℃反应1h消化带有Dam酶模板质粒(pET21a-P3H)，以保留含有随机突变的PCR产物。最后，将酶切产物转化至大肠杆菌BL21中，转化后菌液涂布于筛选平板上，37℃培养8～12h至单菌落形成，建立突变文库。
1.2.2高产H3P菌株的筛选
将筛选平板上长出的单菌落用经灭菌的枪头挑至装有μLLB培养基的96孔板中，在37℃r/min条件下培养6～7h后，按4%接种量接种至装有1.8mL发酵培养基的24孔板中，在30℃r/min培养24h后用1.2.4方法测定产量。根据产量筛选出高产菌并分别接种至装有30mLLB培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，于37℃和r/min培养8h后按其体积分数为4%的接种量转接至30mL发酵培养基中，在30℃和r/min条件下培养，24h后取出1mL菌液于r/min离心2min。取上清液用1.2.4方法测H3P含量，并选取H3P产量较高的菌株进行测序。
1.2.3定点突变
以高产菌中含有目的基因的表达载体(pET21a-P3H)作为模板进行定点突变，引物见1.1.1反应体系(25μL)包含上下游引物各1μL、0.5μLpfu高保真酶、2.5μLpfuBuffer、0.5μLpET21a-P3H高产菌质粒模板、0.5μLdNTPMixture，用无菌水补足。其反应条件为68℃5min；94℃5mins；94℃30s，63℃30s，72℃s，25个循环；72℃延伸10min。然后，用DpnⅠ内切酶在37℃反应1h消化带有Dam酶模板质粒(pET21a-P3H)。最后，将酶切产物转化至大肠杆菌BL21中，转化后菌液涂布于筛选平板上，37℃培养8～12h至单菌落形成。
1.2.4P3H测量方法
(1)在1mL样品中加入0.2mL0.05mol/LCuSO4·5H2O、0.5mL2.5mol/LNaOH、0.5mL质量分数为1%H2O2。混匀。
(2)加入显色剂2mL。称取10g4-(甲氨基)苯甲醛溶于67.5mL异丙醇中，待溶解后加入32.5mL高氯酸。
(3)放入70℃水浴，加热3min。
(4)冷水浴后，在nm处测其吸光值。
2结果与分析2.1P3H测量方法的优化
目前检测发酵液中P3H含量的方法主要有高效液相色谱法和氯胺T法。其中，高效液相色谱法所需仪器昂贵，操作复杂，不适合推广，氯胺T法灵敏度低，反应时间较长，且会与发酵液中其他物质发生显色反应。针对上述不足，本文创建了一种新的检测方法，该项目检测方法取样量少，检测时间短，工艺简单。并且对实验检测方法中加热温度、氧化时间、H2O2浓度和加热时间进行了优化(图1)。优化氧化时间、H2O2浓度时，P3H样品浓度为40mg/L。优化加热时间时，P3H样品浓度为60mg/L。当H2O2浓度大于1%时，H3P会被过度氧化，从而无法正常显色。从结果分析得知，最优的显色条件为加入1%H2O2后，在70℃水浴加热3min。
图1各因素对H3P显色影响Fig.1AlternativeeffectsofthesefactorsonthecoloursofH3P
2.2正向突变体的筛选
2.2.1模板添加量对突变体的影响
传统的易错PCR反应一般利用保真性较低的普通Taq酶，通过在反应体系中添加Mn2+，调节dNTP浓度来达到一定的突变频率。这种方法重复性和简便度不高。本实验中采用随机突变试剂盒进行易错PCR反应，该方法只需要通过调节PCR反应中质粒模板的初始浓度就可以实现对突变频率的控制及调节。
在随机突变过程中，一般认为每个基因中存在1～4个氨基酸的突变为较为适宜的突变频率，同时需要保证具有活性的有效突变体占总数的70%以上。
为了满足以上需求，本实验通过调节PCR反应体系中添加的模板量以调节突变频率。将易错PCR反应体系(50μL)中所添加的模板量分别设定为10、50、、ng，进行易错PCR反应及全质粒PCR反应，在每个添加量基础上，挑取10个转化子进行测序。按照1.2.2中高通量筛选方法进行培养。考察每个模板添加量转化子活性突变体的数量(表3)。因此，本实验中选择在50μL体系中加入ng模板进行易错PCR反应。
表3DNA模板添加量对随机突变库的影响
Table3InfluenceontherandommutationlibrarybyamountofDNAtemplate
2.2.2高产菌的筛选
按照1.2.1的方法进行易错PCR，于50μL体系中加入ng模板质粒pET21a-H3P，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可观察到大约1bp大小的条带，说明P3H基因扩增成功(图2)。以此为引物、表达载体pET21a-H3P为模板，进行全质粒PCR反应，将易错PCR反应获得的突变引入表达载体。将经DpnⅠ消化处理后的PCR产物通过化学方法转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中。37℃过夜培养，获得带有突变的重组菌转化子。挑取单菌落使用1.2.2方法进行高产菌初筛。利用酶标仪测量OD的数值。OD的数值代表其产量。
图2重组大肠杆菌BL21易错PCR的电泳图Fig.2Error-pronePCRelectrophoresisofre北京中科医院曝光治疗白癜风最好的医院
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