兔大肠杆菌的分离鉴定

摘要：从山东、河南、河北等地区送检的病料中分离到9株疑似菌，经细菌培养、形态学检查、生化特性鉴定，鉴定出9株兔大肠杆菌，动物试验能复制出相同病例且SD03株、HN02株、HB01株毒力较强，血清型鉴定为O8(.6%)、O(33.3%)、O18(11.1%)。

关键词：兔;大肠杆菌;分离鉴定

IsolationandIdentificationofPathogenicEscherichiacoliinRabbits

WANGXiao-li,WANGYong-ming,MENGWei-wei,ZHAOFei-fei,LIShi-cheng

(HuahongBiologicalEngineeringCompanyLimitedofShandongProvince,Binzhou)

Abstract:NinegramnegativestrainswereisolatedfromrabbitssuffereddiarrheainShandong、Henan、Hebeirabbitfarms.AlloftheisolatescouldbegrowedonMac-Conkeyagarplatewithredclone,andidentifiedasEscherichiacolibybiochemicaltests.ItwasknownthatthevirulenceofthepathogenicescherichiacoliSD03strain、HN02strainandHB01strainwerestrongthroughtheanimalexperiment,andbelongedtoserotypeO8(.6%)、O(33.3%)、O18(11.1%).

Keywords:Rabbit;Escherichiacoli;Isolationidentification

兔大肠杆菌病也称黏液性肠炎，是由一定血清型的致病性大肠杆菌及其毒素引起的一种爆发性、死亡率很高的仔兔肠道传染病，主要表现为精神沉郁，腹部膨胀，排出细软无形粪便，部分兔粪便干燥呈球状，也有粪便表面包裹有胶胨样物质。随病情发展，病兔出现水样腹泻，有腥臭味，肛门周围、后肢、下腹等处被毛多被污染，病兔多于典型症状出现后1~2天死亡。剖检病变主要在消化道，胃膨大，充满液体和气体，胃黏膜充血出血，小肠黏膜明显出血，内部充满黏性或半透明胶状液体等。据相关报道，该病发病率高达0%~80%，死亡率在10%~20%，给养兔业造成了严重的经济损失[1]。

近年来，我们陆续接收到各地养殖场送检的疑似兔大肠杆菌病的病死兔，我们对病料进行细菌分离培养、染色镜检、生化试验、血清型鉴定及动物试验等，共分离到9株兔大肠杆菌，现将试验结果报告如下。

1.1.1病料山东、河南、河北、四川等地送检的具有典型兔大肠杆菌病症状的发病兔及病死兔，无菌条件下采集肝脏、脾脏、心血及小肠内容物作为分离材料。

1.1.2培养基麦康凯培养基、鲜血马丁琼脂培养基、普通琼脂培养基、营养肉汤培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司及青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.1.3生化试剂各种糖发酵管、甘露醇、MR试剂、VP试剂、尿素酶试剂、H2S试剂等，购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.1.4药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.标准阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.1.6实验动物健康易感试验兔，由山东华宏生物工程有限公司动物实验房提供。

1.1.7其他其他实验所需的试剂及仪器，均由山东华宏生物工程有限公司提供。

1.2.1病料涂片镜检取病兔肝脏、脾脏、心血涂片[2]，分别进行革兰氏染色[3]，镜检，观察结果。

1.2.2病原菌分离培养无菌条件下，取心血、肝脏分别划线接种于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、鲜血马丁琼脂培养基，37℃培养24h；从麦康凯琼脂培养基上选择均匀、典型、红色优势菌落，接种于肉汤培养基，37℃培养24h，纯化备用。

1.2.3生化试验将纯化后的菌液按照常规方法进行生化试验[3]，记录试验结果。

1.2.4药敏试验将纯化后菌液分别接种于麦康凯琼脂培养基，进行药敏试验。

1.2.血清型鉴定将所分离的各菌株纯化培养物用大肠杆菌标准阳性血清进行血清型鉴定。

1.2.6动物回归试验将各分离菌株培养物调节菌液浓度为10×CFU/mL、2×CFU/mL、1×CFU/mL、×CFU/mL,各颈部皮下注射健康易感试验兔[4,]只，观察10日，记录试验结果。

2.1镜检心血、肝脏涂片染色后镜检，可见革兰氏阴性球杆菌，两端钝圆，单个散在或成双排列，未见芽孢和荚膜。

2.2培养特性各分离菌株培养物在普通琼脂平皿上生长良好，形成圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径约为1~3mm的灰白色半透明菌落；在鲜血马丁琼脂培养基上菌落周围无溶血圈产生；培养24h后的普通肉汤呈均匀浑浊，管底有少量白色沉淀物；在麦康凯平皿上长出直径约为1~2mm红色透明菌落，对单个菌落和肉汤培养物涂片染色镜检，均可见与病料涂片所见一直的细菌。

2.3生化试验所分离的9株菌经生化试验鉴定，均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖，均不产生H2S，尿素酶阴性。根据伯杰氏细菌鉴定手册，符合大肠杆菌生化特征。

2.4药敏试验对上述9株菌进行药敏试验，大部分菌株对头孢哌酮舒巴坦、头孢唑林、阿莫西林等敏感，而对林可霉素、利福平、环丙沙星、新霉素等表现为耐药。

2.血清型鉴定对上述9株菌进行血清型鉴定，详细试验结果见表1。

2.6动物回归试验将上述9株分离菌的纯化培养物调节菌液浓度，各颈部皮下注射健康易感试验兔只，1.0mL/只，详细试验结果见下表。

其中有SD02、SD03、HN02、HN04、HB01攻毒后12h内开始出现死亡，48h内80%~%死亡。各攻毒试验兔均出现精神沉郁、严重腹泻等临床症状。剖检死亡试验兔及发病试验兔，均表现典型的兔大肠杆菌临床症状及病理变化，并能从试验兔体内分离到攻毒菌株。

实验室分离的9株兔大肠杆菌，经实验室相关鉴定，各菌株的主要生化特性与伯杰氏细菌鉴定手册中大肠杆菌生化特征相符，有某些糖发酵试验未完全进行，待今后进一步完善。

药敏试验结果表明，各分离菌株主要是对四环素、氯霉素、呋喃妥因、氧氟沙星等敏感，但是与国内的有关报道不一致，这可能是与所分离菌株时间不同、各养殖场用药情况等因素均有关，因此在临床治疗时，有条件的养殖场最好先进行本场药敏试验，筛选出敏感药物后再进行治疗。

我们用大肠杆菌标准阳性血清对所分离到的菌株进行血清定型试验，结果9株菌分属3个血清型，各血清型分别为O8(.6%)、O(33.3%)、O18(11.1%)，优势血清型明显，这为疫苗株血清型的选择提供了良好的依据。

动物回归试验结果表明，所分离的9株菌其中SD03、HN02、HB01株以×CFU/mL浓度攻毒试验兔，能使试验兔/、4/、4/死亡，毒力较强。所有菌株均能引起典型的兔大肠杆菌临床症状，虽然某些菌株未能致死试验兔，但是试验兔表现兔大肠杆菌临床症状，并能从试验兔体内分离到攻毒菌株。本次试验我们采取的攻毒方式为颈部皮下注射，攻毒方式是否会影响菌株毒力试验结果，还有待后继试验的进一步证明。

本次试验未对所分离的各菌株进行免疫原性试验，不能确定各菌株的毒力及免疫原性之间的联系，如要进行相关疫苗的研制过程中疫苗株的确定，需要对各分离菌株进行免疫原性试验，筛选出毒力强、免疫原性良好的菌株对疫苗研制至关重要。

目前养殖场重视兔病毒性出血症、产气荚膜梭菌及多杀性巴氏杆菌病等烈性传染病的免疫防控，但对兔大肠杆菌病的免疫未有足够的重视，而且抗生素的广泛应用导致耐药的大肠杆菌菌株日益增多，一旦发病进行药物治疗效果不理想。采用大肠杆菌疫苗免疫是防控本病的有效途径，而本实验室所分离的菌株、目前流行血清型及动物回归试验等均为未来兔大肠杆菌病相关疫苗的研制奠定了良好的基础。

参考文献：

[1]蔡宝祥.家畜传染病学（第四版）[M].北京：中国农业出版社，.

[2]董常生.家畜解剖学（第四版）[M].北京：中国农业出版社，.

[3]甘肃农业大学.兽医微生物实验指导[M].北京：中国农业出版社，.

[4]东北农业大学.兽医临床诊断学（第三版）[M].北京：中国农业出版社，.

[]安丽英.兽医实验诊断[M].北京：中国农业大学出版社，.

作者简介：王晓丽（-），女，硕士研究生，主要从事兽用生物制品研发工作。E-mail:wangxiaoli

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