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雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达、纯化及结构表征
ExtracellularExpressionandPurificationofRanibizumabin
EscherichiacoliandItsStructuralCharacterization
罗曼玉，高阳，朱建伟，路慧丽*
(上海交通大学药学院，细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心，上海)
摘要：抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体可抑制新生血管的形成和生长，在年龄相关性黄斑变性眼科疾病的临床治疗中具有重要应用价值，特别是已上市的商品名为雷珠单抗的VEGF抗体Fab片段，在市场上取得巨大成功。本研究探索了雷珠单抗在大肠埃希菌中的胞外分泌表达技术，所表达的产品利用SDS-PAGE、WesternBlot、肽谱图全序列分析和纳米差示扫描量热法(NanoDSC)等手段进行了初步的结构表征。结果显示，本研究成功实现了雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达，经过进一步的CaptoL亲和色谱获得了有正确氨基酸序列的Fab产品，经质谱分析具有正确的二硫键配对，且具有与标准品相似的热稳定性，为其进一步的工业生产奠定了基础。
关键词：雷珠单抗；大肠埃希菌；胞外分泌表达；差示扫描量热法；肽谱图
以下为文章节选年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，AMD)是由于眼睛黄斑区视网膜病变而导致的一种慢性进行性不可逆眼科疾病，根据病因及临床表现分为“干性”和“湿性”，其中湿性AMD的主要病理原因是视网膜下脉络膜新生血管的生成及血液泄露损伤视网膜，视力损失发展迅速，最终可导致失明。该病经常发生于50岁以上的中老年人，据估计到年，全球将有2.88亿人受到AMD的影响，仅亚洲就有1.13亿人[1]。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一种能够增加血管通透性，诱导血管生成和内皮细胞增殖的生长因子，抗VEGF抗体可抑制新生血管的产生，从而对湿性AMD起到延缓病程或治疗作用[2—3]。目前全球已经批准的靶向VEGF抗体类药物有贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普、康柏西普及雷莫卢单抗，其中前4个药物都已经用于AMD的一线临床治疗[4—5]。临床试验表明，每月在玻璃体内注射雷珠单抗(基因泰克/诺华)可以防止近95％的患者丧失视力，帮助40％的患者显著改善视力。一些国家的统计数据显示，自引入VEGF拮抗药以来，由AMD而引起的中老年人失明率减少了50％[6]。Ferrara等发现由贝伐单抗的Fab片段衍变而来的雷珠单抗具有较全长IgG更显著的亲和优势[7]，此外，Fab片段的相对分子质量较小，具有较好的组织穿透力，因此更能满足眼科疾病局部用药治疗方案的要求[8]。因此，研究和优化雷珠单抗及其仿制药的生产工艺具有重要价值。在工业生产方面，由于Fab片段发挥作用时无需糖基化等复杂修饰，因此可采用大肠埃希菌系统进行大规模表达。大肠埃希菌细胞生长速度快、外源DNA转化快速简便、诱导表达相对简单且所需培养基成本低廉，在抗体蛋白生产方面具有显著优势。然而，Fab片段为二聚体结构，且含有5对二硫键，在大肠埃希菌中易形成包涵体，不利于下游纯化工艺的放大。有研究将Fab片段在周质空间中进行可溶性表达，但是结果显示由于周质空间有限，产量较低[9]。因此，本试验研究了Fab片段的胞外分泌表达。为方便分离纯化且具有较好的工艺放大可行性，采用碱性磷酸酶启动子(alkalinephosphatasepromoter，PhoA)和热稳定肠毒素Ⅱ信号肽(heatstableenterotoxinⅡsignalpeptide，STⅡ)构建了雷珠单抗胞外分泌表达载体，研究了其在大肠埃希菌中的表达情况，并对表达后的雷珠单抗产品进行纯化和初步的结构表征鉴定。
以下是文章全文：
作者简介：罗曼玉(—)，女，硕士研究生，专业方向：微生物与生化药学。
E-mail：
sjtu.edu.cn
通信联系人：路慧丽(—)，女，研究员，博士，从事微生物与生化药物学研究。
E-mail：roadeer
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