壳寡糖对大肠杆菌的抑制作用

中国组织工程研究与临床康复第13卷第16期-04-16出版

杨玉红

（鹤壁职业技术学院，河南省鹤壁市）

背景：已有实验证明，抗菌抑菌作用是壳寡糖的最主要活性之一。目的：研究壳寡糖对大肠杆菌的抑菌效果。设计、时间及地点：生物工程实验，于-06/-10在河南师范大学微生物实验室完成。

材料：壳聚糖为郑州世纪百川食品添加剂有限公司产品，脱乙酰度93%，相对分子质量。方法：高产壳聚糖酶菌株接种至5L的发酵罐中发酵培养，所得壳聚糖酶粗酶液经乙醇沉淀获得壳聚糖混合酶。壳聚糖混合酶经过HiTrapSP阳离子交换柱分离纯化得壳聚糖外切酶和壳聚糖内切酶，分别用壳聚糖混合酶，壳聚糖外切酶和壳聚糖内切酶降解质量浓度10.0g/L壳聚糖，最终制备5种不同相对分子质量壳寡糖S1，S2，S3，S4，S5，相对分子质量分别为，，，，，在不同浓度不同pH值下对大肠杆菌抑菌活性进行实验分析。主要观察指标：不同相对分子质量的壳寡糖对大肠杆菌生长的影响；不同质量浓度壳寡糖对大肠杆菌抑菌活性；pH值对壳寡糖抑菌活性的影响。结果：在8h之内，5种壳寡糖对大肠杆菌均有明显的抑菌效果。培养8h之后：S1，S4和S5的抑菌效果逐渐减弱。培养16h之后：S1培养基中大肠杆菌的数量超过正常状态。相对分子质量的壳寡糖对大肠杆菌抗菌作用最强。其抑菌作用随壳寡糖质量浓度的增加而增强。测得pH值5.0，5.5，6.0，6.5和7.0壳寡糖S2溶液对大肠杆菌抑菌活性分别为0.，0.，0.，0.，0.，在pH值6.0附近，壳寡糖S2对大肠杆菌抑制作用最好。

结论：壳寡糖的相对分子质量大小是抑制大肠杆菌生长的主要影响因素。

壳寡糖；酶降解；相对分子质量；抗菌doi:10./j.issn.-..16.

R

A

-()16--04

引言

壳寡糖是氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的相对分子质量低于的低聚糖。低黏度和良好的水溶性使壳寡糖比壳聚糖展现出更独特的生理活性和功能性质[1-3]。抗菌抑菌作用是壳寡糖的最主要活性之一[4-5]。壳寡糖在食品领域有广泛的用途[6-8]。Enrique等[3]提出其可作为食品天然防腐剂和添加剂。壳寡糖具有柔和甜味，可作为糖尿病和肥胖病患者的可食甜味剂[9-10]。此外壳寡糖还具有抗癌、降血脂、清除自由基、消除脂肪肝、降低胆固醇、增强人体免疫力等功能[11-19]。在美国、韩国、日本等国家，壳寡糖已被广泛应用于食品领域[20-21]。壳聚糖酶按酶切方式可以分为壳聚糖内切酶和外切酶[22]。酶法降解壳聚糖是生产壳寡糖的最佳方法[23]。壳寡糖对各种病原微生物的抗菌能力有所不同[24-25]。Jeon等[26]指出相对分子质量是壳寡糖抑制微生物生长的最重要因素。作者就由壳聚糖内切酶、外切酶和混合酶降解制备的5种不同相对分子质量(范围在~)壳寡糖对大肠杆菌的抗菌活性进行分析。

1、材料和方法

设计：生物工程实验。

时间及单位：于-06/-10在河南师范大学微生物实验室完成。

材料：

实验方法：

壳寡糖的制备：高产壳聚糖酶菌株接种至5L的发酵罐中发酵培养，30℃、r/min，培养65~70h后停止发酵。发酵液经抽滤后，用截留相对分子质量的超滤膜滤除无机盐和大相对分子质量蛋白质。所得壳聚糖酶粗酶液经乙醇沉淀获得壳聚糖混合酶。壳聚糖混合酶经过HiTrapSP阳离子交换柱分离纯化得壳聚糖外切酶和壳聚糖内切酶[27]。分别用壳聚糖混合酶，壳聚糖外切酶和壳聚糖内切酶降解质量浓度10.0g/L壳聚糖。加酶量10U/L，反应条件为30℃、pH值为5.0，通过特性黏度控制反应时间。沸水浴加热中止反应。喷雾干燥，最终得壳寡糖产品S1，S2，S3，S4，S5，实验中通过乙酰丙酮的方法[28]测定了这5种不同分子量的壳寡糖产品，它们的相对分子质量分别为，，，，。S1由壳聚糖外切酶降解制备；S3由壳聚糖内切酶降解制备；S2、S4、S5均由壳聚糖混合酶降解制备。壳聚糖相对分子质量和特性黏度间的关系由MHS方程确定[29-30]。比浊法测定壳寡糖对细菌生长速率的影响:称取一定量的壳寡糖溶解于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，配成质量浓度2.0g/L含药培养基，分装在三角瓶中(50mL/瓶)。灭菌冷却后每瓶加1.0mL菌悬液(菌浓度为1×cfu/L)，置于空气浴摇床中，37℃、r/min培养，每隔4h取样。分光光度计于nm处测定细菌培养液的吸光度值。牛津杯法测定壳寡糖对大肠杆菌抑菌活性：配制不同质量浓度的壳寡糖溶液，灭菌后备用。移取0.2mL菌悬液到平板上，涂布均匀。放置3个无菌牛津杯于平板上。各移取0.2mL壳寡糖溶液加入牛津杯，以无菌水为对照。37℃恒温培养24h，用HiCC-S扫描型全自动菌落计数仪及抑菌圈测定仪测定抑菌圈直径。每种浓度重复3次试验，各组值均采用均数表示。pH值对抑菌活性的影响：配制含质量浓度1.0g/L壳寡糖S2的液体培养基，调节培养基pH值至5.0，5.5，6.0、6.5和7.0。接种后37℃培养24h。分光光度计于nm处测定细菌培养液的吸光度值。

主要观察指标：不同相对分子质量壳寡糖对大肠杆菌生长的影响，壳寡糖质量浓度与大肠杆菌抑菌活性的关系，pH值对壳寡糖抑菌活性的影响。

设计、实施、评估者：设计、实施、评估者均由作者本人完成，采用盲法评估。

统计学分析：由第一作者使用SuperANOVA统计软件进行数据分析，各组数值均采用均数表示，组间采用t检验，P0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1pH值对壳寡糖抑菌活性的影响选取对大肠杆菌抑菌效果最好的壳寡糖S2进行实验。测得pH值5.0，5.5，6.0，6.5和7.0壳寡糖S2溶液对大肠杆菌抑菌活性分别为0.，0.，0.，0.，0.，在pH值6.0附近，壳寡糖S2对大肠杆菌抑制作用最好。2.2不同质量浓度壳寡糖对大肠杆菌抑菌活性S2、S3、S4、S5对大肠杆菌均有抑菌活性，随着质量浓度提高抑菌活性增强。其抑菌能力大小排列如下：S2S3S4S5。S2与S3的抑菌能力相差不大，与S4和S5有较大差别。S1对大肠杆菌无抑制作用。见表1。

2.3壳寡糖对细菌生长曲线的影响

影响变化：

在8h之内：5种壳寡糖对大肠杆菌均有明显的抑菌效果。培养8h之后：S1、S4和S5的抑菌效果逐渐减弱。培养16h之后：S1培养基中大肠杆菌的数量超过空白。

3、讨论

夏文水等[31]对不同脱乙酰度的壳寡糖抑制大肠杆菌的实验作了研究，结果发现，壳寡糖的抑菌率随着脱乙酰度的升高，即随氨基含量的升高而增大。严钦等[32]实验认为，壳寡糖因为具有质子化铵，能与细菌带负电荷的细胞膜作用，干扰细菌细胞膜功能，造成细菌体内细胞质流失，扰乱细胞的正常生理代谢，从而达到杀菌的目的。而在pH为中性时，壳寡糖中的氨基没有被质子化，因而不能抑制细胞的生长，反而是作为一种糖被细菌利用。杨宇民等[33]实验认为，样品溶液pH值为7.2时，壳寡糖对大肠杆菌没有抑菌性。杨声等[34]采用固体培养基体外抑菌法，证明了壳寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的抑菌作用。结果表明，壳寡糖在1%HAc中的抑菌性强于在水中的抑菌性。本实验研究结果表明，样品溶液初始pH值为6.0，壳寡糖对大肠杆菌的抑菌效果最好，这与国内外的研究结果基本一致。刘明河等[35]用甲壳低聚糖(相对分子质量为，脱乙酰度为72%)对食品中一些常见的细菌、霉菌、酵母菌进行抑菌试验。发现甲壳低聚糖对大肠杆菌、四联球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、伤寒沙门氏杆菌和痢疾志贺氏菌等八种受试菌有抑制作用，其抑菌率随着质量浓度的增加率逐渐变大。有资料表明，壳寡糖由于相对分子质量小，易于透过细菌胞膜进入细胞质和细胞核内，使其细胞内部起生物活性的相关酶发生泄露，同时与带负电荷的物质如DNA相互作用，干扰DNA的复制与转录，从而发挥其抗微生物活性[36-38]。

本实验验证了不同酶切方式制备的壳寡糖对大肠杆菌的抑制作用，实验结果表明，采用不同酶切方式制备壳寡糖会影响壳寡糖的抑菌活性，壳聚糖外切酶制备的样品含有大量的单糖，能促进大肠杆菌的生长。酶法降解所得壳寡糖的相对分子质量大小是抑制大肠杆菌生长的主要影响因素，相对分子质量较小的壳寡糖在抑制大肠杆菌时有更明显的效果。在供试样品中，相对分子质量的壳寡糖对大肠杆菌抗菌作用最强，其抑菌作用随壳寡糖质量浓度的增加而增强，本文图1中，在8h之内，5种壳寡糖对大肠杆菌均有明显的抑菌效果。培养8h之后，S1、S4和S5的抑菌效果逐渐减弱。培养16h之后S1培养基中大肠杆菌的数量超过空白。原因是S1由壳聚糖外切酶降解制备，含有大量的单糖，能被大肠杆菌作为碳源利用，促进其生长；在8h之内，S1培养基中原有碳源相对充足，S1中含有的单糖不被大肠杆菌作为碳源利用，S1壳寡糖对大肠杆菌有明显的抑菌效果，培养16h之后，培养基中原有碳源相对不足，S1中含有的大量单糖，能被大肠杆菌作为碳源利用，反而促进其生长。因此，出现了图1中S1的抑菌活性与对照相比先低后高的现象。S4、S5相对分子质量较高，高相对分子质量的壳寡糖对大肠杆菌抑制作用不强。而S3和S2在整个过程中均保持强抑菌能力，S2的抑菌能力比S3强。添加S3和S2样品的培养基在培养8h之后吸光度一直保持在较低的稳定生长范围，表明S3和S2基本上完全抑制了大肠杆菌的生长。

参考文献

[1]刘幸海,李正名,王宝雷.具有农业生物活性壳寡糖的研究进展[J].农药学学报,，8(1):1-7．

[2]严金龙,许琦,蔡照盛,等.甲壳低聚糖的制备、特性与应用研究进展[J].安徽化工,,31(1):24-27．

[3]苏广宇,刘四新,李从发.甲壳素/壳聚糖的研究与应用概况[J].广东农业科学,,43(2):-．

[4]李隽芝．壳聚糖的生理活性及其在保健食品中的应用[J].明胶科学与技术,,24(4):-．

[5]魏新林,夏文水.甲壳寡糖的生理活性研究进展[J].中国药理学通报,,19(6):-．

[6]EnriqueA，MarlaSR，VivianaR，etal.Presentandfutureroleofchitinandchitosaninfood．MacromolecularBioscience.;3(10)：-．

[7]郑磊,崔慧斐.壳聚糖抗微生物活性及其作用机制的研究近况[J].食品与药品,,10(6):58-62.

[8]张丽，臧素敏.新型饲料添加剂壳寡糖的应用开发[J].兽药与饲料添加剂,,12(3):16-17.

[9]曹朝晖,董晓英,敏方,等.甲壳低聚糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响及降血糖作用[J].中国生化药物杂志,,26(6):-.

[10]阎春玲,刘兵,刘万顺.壳寡糖及其衍生物对糖尿病大鼠糖耐量及肠道微生态平衡的影响[J].世界华人消化杂志,,15(11):-.

[11]官杰,罗晓庆,王琪,等.壳寡糖抑制肿瘤作用的实验研究[J].中国免疫学杂志,,23(5):-.

[12]官杰,罗晓庆,钱丽丽,等.壳寡糖与双歧杆菌对肿瘤协同抑制的实验研究[J].中华中医药学刊,,25(6):-.

[13]吴海明,华晓阳,何登全.壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机理的研究[J].中华医学研究杂志,,5(8):-.

[14]胡迎青,陆雪华,汪晓莺.壳寡糖降血脂作用及与RAP的表达相关性研究[J].中国临床医学,,14(6)-.

[15]刘冰,刘万顺,韩宝芹,等.壳寡糖及其衍生物对实验性糖尿病大鼠调节血脂和抗氧化作用[J].山东大学学报:理学版,,41(4):-.

[16]乔莹,白雪芳,杜昱光.壳寡糖医药保健功能的研究进展[J].中国生化药物杂志,,29(3):-.

[17]王亚红,曲小姝,祝波.壳聚糖及其衍生物在医药领域的应用[J].天津化工,,19(5):7-10.

[18]陈虹,侯伟革,臧素敏.壳寡糖对鹌鹑生产性能和免疫功能的影响[J].经济动物学报,,10(1):18-21.

[19]窦江丽,白雪芳,杜昱光,等.壳寡糖对小鼠免疫系统的调节作用[J].中国海洋药物杂志,,24:33-35.

[20]WangJ,CaoWQ,YangX.ShipinKeji.;32(12):82-85.王静,曹维强,杨鑫.溶性壳寡糖的制备及其对双歧杆菌的增殖作用[J].食品科技,,32(12):82-85.

[21]郝林华,王晓滨,陈靠山,等.功能性寡糖的研究进展与应用[J].饲料工业,,26(12):54-59.

[22]叶淑红,孙浩,陈丽,产壳聚糖酶菌株的筛选及壳寡糖性质的研究[J],食品研究与开发,,28(01):23-26.

[23]韩永萍,林强.低聚壳聚糖制备及其生理活性进展[J].化学工业与工程,,24(3):-．

[24]陈威，吴清平，张菊梅，等.壳聚糖抑菌机制的初步研究[J].微生物学报,,48(2):-.

[25]曹维强,王静,佘永新,等.壳寡糖对肠道致病菌抑制作用的研究[J].食品科学,,29(4):-.

[26]JeonYJ，ParkPJ，KimSK，eta1．Antibacterialeffectofchitoo“gosaccharidesproducedbybioreactor．CarbohydratePolymers.l;44(1):71-76．

[27]舒晓宏,韩伶伶,李墨林,等.甲壳素及壳聚糖制备方法的改进[J].中国海洋药物,,25(4):55-57.

[28]韩宝芹,位晓娟,房子.乙酰丙酮法测定甲壳胺寡糖数均分子量[J].中国海洋药物,,23(6)：12-17.

[29]KasaaiMR，ArulJCharletC．Intrinsicviscosity-molecularweightrelationshipforehitosan．JournalofPolymerScience(PartB)：PolymerPhysics，0,38(19):-．

[30]方文建,隋斯光,郑连英.壳聚糖相对分子质量的测定方法[J].化工进展,,25(4):-．

[31]夏文水,张帆,何新意.甲壳低聚糖抗菌作用及其在食品保藏中的应用[J].无锡轻工大学学报,,17(4):10-14.

[32]严钦，沈月新，王慥.壳寡糖的制备及其抑菌性能研究[J].食品研究与开发,,4(2):6-29.

[33]杨宇民，马振祥，尹继成,等.系列水溶性壳聚糖衍生物的抑菌性能研究[J].中国公共卫生,,21(9):-.

[34]杨声,冯小强,苏中兴,等.水溶性壳聚糖和壳寡糖的吸湿、保湿性能及对几种致病菌的抑制作用研究[J].中国化妆品,,14(6):82-84.

[35]刘明河,吴清华.甲壳低聚糖抑菌性能鉴定[J]..生物技术,,36(3):36-38.

[36]杨声,冯小强,伏国庆,等.水溶性壳聚糖对几种常见菌的抑制作用及其机理初探[J].中国酿造,,26(5):15-18.

[37]刘碧源,陈丽丽,任林,等.壳寡糖与壳聚糖抗微生物活性的比较[J].南华大学学报:医学版，,33(3):-.

[38]孙海香,宋保强,夏枚生,等.不同相对分子质量的壳聚糖对大肠杆菌K88的抑制作用[J].中国畜牧杂志,,41(7):30-31.

作者简介：杨玉红★，女，年生，河南省鹤壁市人，年河南师范大学毕业，硕士，副教授，主要从事食品微生物学方面的研究。yuzhao

转载请注明：http://www.xueyauny.com/drlb/713.html

• 上一篇文章： 穴位配好对使用效果更好
  
• 下一篇文章： 大肠癌和息肉有关，和年龄无关南宁中南医